國際趨勢文章分享-目標基因定量技術應用於調查整治場址（106/02）2017/07/20
一般歸類需要調查整治的場址中必定存有會危害人類健康或是周遭環境的特定污染物，在生物復育執行前期，需先了解現地場址中是否存在具有降解此污染物的微生物菌群，以決定後續的整治策略是以只添加營養鹽，或是需投入生物製劑來進行污染物分解。且需於生物復育執行期間，需要檢測具有降解能力指標的功能性基因是否與現地污染物轉化具有相關性變化。因此，如何快速且準確地定量場址中的目標基因為一重要的課題。
qPCR法為目前常用於定量現地場址中目標基因之技術，結合傳統PCR技術與螢光偵測之方法，對目標基因片段進行定量分析，利用PCR的熱循環反應中即時偵測螢光累積量，並藉由已知濃度的標的基因與其在PCR對數放大初期之螢光強度的線性關係，建立檢量線以計算未知樣品中標的基因濃度。 在量測時，標的DNA的專一性是由設計的引子序列（SYBR Green）或引子加上探針序列（TaqMan chemistry）所提供。另外，結合qPCR與反轉錄（reverse transcription）反應，則可對mRNA的濃度進行量測，稱之為reverse-transcription Quantitative PCR （RT-qPCR）。 在標的基因方面，主要分為分類學標記（taxonomic markers，如ribosomal genes）和功能性標記（functional markers，如位於功能蛋白上相對應基因）兩種，分類學標記能用定量微生物的豐富度，而功能性標記則用於評估微生物社群中目標功能的潛在表現。
qPCR定量方法雖然具有相當大的優勢，但在實際應用上仍有需要注意的地方與使用上的限制，其中最重要的有核酸萃取方式、引子探針的設計、及實驗數據的分析，環境樣品中核酸的萃取方式等，如果需要在不同樣品間做比較，需使用一致的萃取方法。此外，PCR抑制物質也常出現在環境樣品核酸萃取液中，因此如何確定qPCR之數據沒有低估標的DNA的數量，則需要在實驗中對所萃取核酸的品質進行驗證。由於在量測低濃度時數據誤差較大，並容易受到背景的干擾，實驗設計上，亦需提供無標地實驗控制組 （No Template Control，NTC）等之結果加以驗證。
在qPCR技術應用上，以氯烯類污染場址為例，因Dehalococcoides屬中不同種（species）和株（strain）能在厭氧狀態下，分工合作將高氯數乙烯化合物（四氯乙烯（PCE）和三氯乙烯（TCE））還原脫鹵至低氯數乙烯化合物（二氯乙烯（DCE）、氯乙烯（VC）），最終為乙烯（ETH）。 因此，定量Dehalococcoides屬16S rRNA基因在含氯乙烯污染場址中的存在與否及數量多寡，與場址是否能成功復育有高度的關聯性。 此外，不同Dehalococcoides菌種或菌株的16S rRNA基因相似度極高，而其脫鹵呼吸作用中的電子接受者卻大不相同，所以僅有同時分析Dehalococcoides屬的16S rRNA及其還原脫鹵功能性基因之濃度，才能對還原脫鹵反應的潛勢有更精確的評估，因此以qPCR技術分析16S rRNA及其還原脫鹵功能性基因之數量 （DNA）及活性 （cDNA），為目前發展之趨勢。
Behrens et al. （2008）以qPCR分析連續流管柱中Dehalococcoides屬的16S rRNA及pceA、tceA、vcrA、bvcA基因，實驗中PCE在管柱中被完全降解至乙烯，且進流處之降解率最高，剛好也是Dehalococcoides 16S rRNA基因濃度最高之處，bvcA為實驗中表現量最高的基因，且集中於管柱的進流端。 van der Zaan （2010）於150個監測井中監測Dehalococcoides的16S rRNA及tceA、vcrA、bvcA基因，並與現地水質化學資料進行關聯性分析，發現Dehalococcoides的16S rRNA與溶解性有機碳（dissolve organic carbon）和適合氯乙烯類化合物降解條件有關，而vcrA基因數量則與含氯乙烯化合物濃度間具顯著的相關性。 另外在一受TCE污染的場址中，經過生物添加和生物促進的施用下，Dehalococcoides屬的16S rRNA基因數量增加了1,000倍，處理末期VC及乙烯的產生也與vcrA、bvcA基因的出現相符。
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